Reakcja łańcuchowa polimerazy


Na tę stronę wskazuje przekierowanie z „PCR”. Zobacz też: inne znaczenia dla „PCR”.

Reakcja łańcuchowa polimerazy, łańcuchowa reakcja polimerazy, PCR (od ang. polymerase chain reaction) – metoda powielania łańcuchów DNA polegająca na łańcuchowej reakcji polimerazy DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki, w warunkach laboratoryjnych. Technika ta została opracowana w roku 1983 przez Kary’ego Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w 1993 Nagrodę Nobla.

Znajduje ona wiele zastosowań, między innymi w badaniach nad genomem, charakteryzowaniu ekspresji genów, klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, paleontologii.

Spis treści

Składniki mieszaniny reakcyjnej


Do reakcji doprowadza się:

Czasem dodaje się jeszcze inne składniki, na przykład roztwór tRNA (chroniący inne składniki mieszaniny przed adsorpcją na ściankach naczynia) lub barwniki i wskaźniki informujące o przebiegu reakcji (szczególnie w modyfikacjach PCR).

Przebieg reakcji


Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w różnych temperaturach. Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej.

  1. Denaturacja. Polega na rozpleceniu podwójnej helisy matrycowego DNA (lub mRNA, jeśli stanowi matrycę). W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 °C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej, do wymaganych 95 °C, na 15 sekund.
  2. Przyłączanie starterów (hybrydyzacja). Jest to tworzenie odcinków dwuniciowych składających się z przygotowanych starterów (cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających namnażany gen) i matrycowej cząsteczki DNA. Etap ten przebiega w niższej temperaturze, ściśle określonej dla danej pary starterów (45–60 °C), które przyłączają się do matrycy DNA. Ponieważ roztwory starterów są dodawane w dużym nadmiarze w stosunku do matrycy, jest bardzo mało prawdopodobne, żeby na tym etapie zamiast hybryd starter–matryca utworzyły się hybrydy połączonych z sobą dwóch nici matrycy.
  3. Wydłużanie łańcucha (elongacja). Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 °C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, w wyniku czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.

Następnie cykl powtarza się i w kolejnym etapie przyłączania starterów i elongacji jako matryca mogą służyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cząsteczki genu. W ten sposób reakcja, dopóki substraty i enzym są w wystarczającej ilości, zachodzi coraz szybciej, powodując coraz większy przyrost kopii genu na etapie wydłużania.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek. W praktyce wydajność procesu jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego łańcucha DNA. Konwencjonalna technika PCR pozwala na namnażanie łańcuchów DNA o maksymalnej długości około 10 kpz.

Modyfikacje PCR


Stosuje się również modyfikacje metody PCR, między innymi:

Zalety metody


PCR jest bardzo użytecznym narzędziem w różnego typu badaniach genetycznych, ponieważ:

Przypisy


Wikimedia Commons ma galerię ilustracji związaną z tematem:
Reakcja łańcuchowa polimerazy
  1. a b Polskie nazwy starterów wg Agnieszka Sok: Praca doktorska. Poznanie sekwencji genu białka wiążącego hormon juwenilny z Galleria mellonella . Politechnika Wrocławska. Wydziałowy Zakład Biochemii, 2007. s. 52. [dostęp 2009-10-15]. [zarchiwizowane z tego adresu (2010-10-11)].
  2. Christopher M Hindson i inni, Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR , „Nature Methods”, 10 (10), s. 1003–1005, DOI10.1038/nmeth.2633 , PMID23995387 , PMCIDPMC4118677 .
  3. a b Jakub Barylski: PCR – najpopularniejsza metoda badania DNA . IGM Internetowa Gazeta Medyczna nr 3, 7 lutego 2009. [dostęp 2011-08-31].
  4. H. Ochman, A.S. Gerber, D.L. Hartl. Genetic applications of the inverse polymerase chain reaction. „Genetics”. 120, s. 621–623, 1988. PMID: 2852134 . 
  5. J. Veraslovic, T. Koeuth, R.J. Lupski: Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. „Nucleic Acids Res.”, 1991, 19 (24), s. 6823–6831.









Kategorie: Biologia molekularna | Genetyka | Wynalazki nagrodzone Nagrodą Nobla




Informacje na dzień: 24.09.2021 11:42:23 CEST

Źródło: Wikipedia (Autorzy [Historia])    Licencja: CC-BY-SA-3.0

Zmiany: Wszystkie zdjęcia i większość powiązanych z nimi elementów projektu zostały usunięte. Niektóre ikony zostały zastąpione przez FontAwesome-Icons. Niektóre szablony zostały usunięte (np. „Artykuł wymaga rozszerzenia) lub przypisane (np.„ Przypisy ”). Klasy CSS zostały usunięte lub zharmonizowane.
Usunięto linki do Wikipedii, które nie prowadzą do artykułu lub kategorii (takie jak „Redlinki”, „linki do strony edycji”, „linki do portali”). Każde łącze zewnętrzne ma dodatkową ikonę FontAwesome. Oprócz drobnych zmian w projekcie usunięto kontener multimediów, mapy, pola nawigacji, wersje mówione i geomikroformaty.

Proszę zanotować: Ponieważ podana treść jest automatycznie pobierana z Wikipedii w danym momencie, ręczna weryfikacja była i nie jest możliwa. Dlatego LinkFang.org nie gwarantuje dokładności i aktualności pozyskanych treści. Jeśli istnieją informacje, które są obecnie niepoprawne lub mają niedokładny wygląd, prosimy o Skontaktuj się z nami: e-mail.
Zobacz też: Znak firmowy wydawcy & Polityka prywatności.